Fluorescenční filtr je základní součástí fluorescenčního mikroskopu. Typický systém má tři základní filtry: excitační filtr, emisní filtr a dichroické zrcadlo. Běžně jsou baleny v krychli tak, že se skupina společně vloží do mikroskopu.
Jak funguje fluorescenční filtr?
Filtr buzení
Excitační filtry propouštějí světlo určité vlnové délky a blokují jiné vlnové délky. Lze je použít k výrobě různých barev vyladěním filtru tak, aby propouštěl pouze jednu barvu. Budicí filtry se dodávají ve dvou hlavních typech — dlouhé propusti a pásmové propusti. Budič je obvykle pásmový filtr, který propouští pouze vlnové délky absorbované fluoroforem, čímž se minimalizuje excitace jiných zdrojů fluorescence a blokuje excitační světlo v pásmu fluorescenční emise. Jak ukazuje modrá čára na obrázku, BP je 460-495, což znamená, že může projít pouze fluorescencí 460-495nm.
Je umístěn v osvětlovací dráze fluorescenčního mikroskopu a filtruje všechny vlnové délky světelného zdroje kromě oblasti excitace fluoroforu. Minimální propustnost filtru určuje jas a brilanci snímků. Pro jakýkoli filtr buzení se doporučuje minimálně 40% prostup, aby byl ideálně > 85%. Šířka pásma excitačního filtru by měla být zcela v rozsahu excitace fluoroforu tak, aby střední vlnová délka (CWL) filtru byla co nejblíže vlnové délce špičkové excitace fluoroforu. Optická hustota (OD) excitačního filtru určuje tmavost obrázku na pozadí; OD je měřítkem toho, jak dobře filtr blokuje vlnové délky mimo přenosový rozsah nebo šířku pásma. Doporučuje se minimální OD 3,0, ale ideální je OD 6,0 nebo větší.
Emisní filtr
Emisní filtry slouží k tomu, aby umožnily požadované fluorescenci ze vzorku dosáhnout detektoru. Blokují kratší vlnové délky a mají vysokou propustnost pro delší vlnové délky. Typ filtru je také spojen s číslem, např. BA510IF na obrázku (filtr interferenční bariéry), toto označení se vztahuje k vlnové délce při 50 % jeho maximálního propustnosti.
Stejná doporučení pro excitační filtry platí pro emisní filtry: minimální přenos, šířka pásma, OD a CWL. Emisní filtr s ideální kombinací CWL, minimální propustností a OD poskytuje nejjasnější možný obraz s nejhlubším možným blokováním a zajišťuje detekci nejslabších emisních signálů.
Dichroické zrcadlo
Dichroické zrcadlo je umístěno mezi excitačním filtrem a emisním filtrem pod úhlem 45° a odráží excitační signál směrem k fluoroforu a zároveň vysílá emisní signál směrem k detektoru. Ideální dichroické filtry a rozdělovače paprsků mají ostré přechody mezi maximálním odrazem a maximální propustností, s >95% odrazem pro šířku pásma excitačního filtru a propustností >90% pro šířku pásma emisního filtru. Vyberte filtr s ohledem na průsečíkovou vlnovou délku (λ) fluoroforu, abyste minimalizovali rozptýlené světlo a maximalizovali poměr signálu k šumu fluorescenčního obrazu.
Dichroické zrcadlo na tomto obrázku je DM505, pojmenované tak, protože 505 nanometrů je vlnová délka při 50 % maximální propustnosti pro toto zrcadlo. Křivka prostupu pro toto zrcadlo ukazuje vysokou propustnost nad 505 nm, strmý pokles propustnosti nalevo od 505 nanometrů a maximální odrazivost nalevo od 505 nanometrů, ale stále může mít určitou propustnost pod 505 nm.
Jaký je rozdíl mezi dlouhými a pásmovými filtry?
Fluorescenční filtry lze rozdělit do dvou typů: long pass (LP) a band pass (BP).
Dlouhé propusti propouštějí dlouhé vlnové délky a blokují ty kratší. Mezní vlnová délka je hodnota při 50 % špičkového přenosu a všechny vlnové délky nad mezním jsou přenášeny dlouhými propustmi. Často se používají v dichroických zrcátkách a emisních filtrech. Dlouhé propustné filtry by se měly používat, když aplikace vyžaduje maximální sběr emisí a když spektrální rozlišení není žádoucí nebo nutné, což je obecně případ sond, které generují jeden emitující druh ve vzorcích s relativně nízkou úrovní autofluorescence pozadí.
Pásmové filtry přenášejí pouze určité vlnové pásmo a blokují ostatní. Snižují přeslechy tím, že umožňují přenášení pouze nejsilnější části fluoroforového emisního spektra, snižují autofluorescenční šum a tím zlepšují poměr signálu k šumu ve vzorcích autofluorescence s vysokým pozadím, které filtry s dlouhou propustí nemohou nabídnout.
Kolik typů sad fluorescenčních filtrů může BestScope dodat?
Některé běžné typy filtrů zahrnují modré, zelené a ultrafialové filtry. Jak je uvedeno v tabulce.
| Sada filtrů | Filtr buzení | Dichroické zrcadlo | Bariérový filtr | Vlnová délka LED lampy | Aplikace |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485 nm | ·FITC: Fluorescenční protilátková metoda ·Acidinová oranž: DNA, RNA ·Auramin: Tuberkulózní bacil ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | 570 DM | BA575 | 535 nm | ·Rhodamin, TRITC: Fluorescenční protilátková metoda ·Propidium jodid: DNA · RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365 nm | · Auto-fluorescenční pozorování ·DAPI: barvení DNA ·Hoechest 332528, 33342: používá se pro barvení chromozomů |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405 nm | · Katecholaminy · 5-hydroxytryptamin ·Tetracyklin: kostra, zuby |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640 nm | ·Cy5 · Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Sady filtrů, které se používají při fluorescenčních akvizicích, jsou navrženy na základě hlavních vlnových délek používaných ve fluorescenčních aplikacích, což je založeno na nejpoužívanějších fluoroforech. Z tohoto důvodu jsou také pojmenovány podle fluoroforu, pro který jsou určeny, jako jsou filtrační kostky DAPI (modrá), FITC (zelená) nebo TRITC (červená).
| Sada filtrů | Filtr buzení | Dichroické zrcadlo | Bariérový filtr | Vlnová délka LED lampy |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485 nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365 nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535 nm |
| FL-Auramin | BP470 | DM480 | BA485 | 450 nm |
| Texaská červená | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560 nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560 nm |
Jak si vybrat fluorescenční filtr?
1. Principem výběru fluorescenčního filtru je nechat fluorescenční/emisní světlo procházet zobrazovacím koncem tak daleko, jak je to jen možné, a zároveň zcela blokovat excitační světlo, aby se dosáhlo nejvyššího poměru signálu k šumu. Zejména pro použití vícefotonového buzení a totálního interního reflexního mikroskopu způsobí slabý šum také velké rušení zobrazovacího efektu, takže požadavek na odstup signálu od šumu je vyšší.
2. Znát excitační a emisní spektrum fluoroforu. Aby se vytvořila sada fluorescenčních filtrů, která generuje vysoce kvalitní, vysoce kontrastní obraz s černým pozadím, měly by excitační a emisní filtry dosahovat vysoké propustnosti s minimálním zvlněním propustného pásma v oblastech, které odpovídají excitačním špičkám nebo emisím fluoroforu.
3. Zvažte životnost fluorescenčních filtrů. Tyto filtry musí být nepropustné pro intenzivní zdroje světla, které generují ultrafialové (UV) světlo, které by mohlo vést k „vyhoření“, zejména filtru budiče, protože je vystaven plné intenzitě zdroje osvětlení.
Různé fluorescenční ukázkové obrázky
Zdroje jsou shromažďovány a organizovány na internetu a slouží pouze k učení a komunikaci. Pokud dojde k nějakému porušení, kontaktujte nás, abychom je odstranili.
Čas odeslání: prosinec-09-2022